2016年執(zhí)業(yè)藥師《藥物分析》考試預習資料（30）

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　　酶的提取

　　胞外酶可以直接進行提取分離;胞內游離存在的“離酶”以及與顆粒體(如細胞核、線粒體、微粒體、質膜)結合的“結酶”都有一個破碎細胞過程，“結酶”還有一個轉變成水溶液的問題。因此對酶類的提取要采用多種方法，常用的細胞破碎法如下：

　　機械法：如絞碎、刨碎、勻漿、研磨、擠壓或超聲波等。研磨時還可加入細砂、石英粉、氧化鋁等以利細胞破碎。

　　化學法：用鹽、堿、表面活性劑、EDTA、丙酮和正丁醇等可使細胞破碎、顆粒體結構解體，從而把酶釋放出來。例如常將胰臟用數倍量丙酮處理2～3次，制成丙酮粉供多種酶的提取用;用膽酸鹽處理膜結構上的脂蛋白和“結酶”，使兩者形成復合物，并帶上靜電荷，由于電荷之間的排斥作用，使膜破裂，達到溶解。

　　酶解法：用組織自溶或用溶菌酶、脫氧核糖核酸酶、磷脂酶等降解細胞膜結構，然后再進行提取。但應知道組織自溶法對某些酶的提取是不利的，如胰蛋白是以酶原形式純化后再激活成胰蛋白酶的，若用自溶法提取，酶原已轉成酶，純化就很困難。而用純的工具酶降解法是無此缺點，但成本較高。

　　凍融法：采用反復冷凍與融化時由于細胞中形成了冰晶及剩余液體中鹽濃度的增高可以使細胞破裂。

　　酶的提取溶劑可以用水、一定濃度的乙醇、乙二醇、丁醇和稀鹽溶液、緩沖溶液等;也可以用稀堿或稀酸溶液，如用稀硫酸提取胰蛋白酶，用稀鹽酸提取胃蛋白酶。溶劑用量一般為原料重量的1～5倍。攪拌可加速提取，但轉速不宜太快，否則會產生泡沫而難以過濾或使酶變性。多數酶的提取要在50C以下操作，但有的酶在較高溫度下提取更好，如胃蛋白酶在450C提得收率較高，一般可在一5～+400C間適當選擇。提取液的pH應在酶的穩(wěn)定pH范圍內，并應遠離其等電點的pH為宜，如蛋白酶選用pH2.5～3，0，胰蛋白酶和α一糜蛋白酶則用0.25 N硫酸提取。若在中性或堿性提取時，最常用的是0.15 mol/L氯化鈉、0.02～0.05mol/L磷酸緩沖液、0.02-0.05mol/L焦磷酸緩沖液。正丁醇的親脂性強，能透入酶的脂質結合物中，又兼有親水性，有類似表面活性劑的作用，適用于提取“結酶”。

　　為了減少提取液體積，可用多段逆流提取或柱型抽提法。液渣分離可用過濾法(如板框壓濾、旋轉真空過濾)或離心法。過濾時可加硅藻土、紙漿等為助濾劑。離心時可加入氫氧化鋁凝膠、磷酸鈣凝膠等以除去懸浮的膠體物質。

　　雜質的去除

　　酶提取液中常含有雜蛋白、多糖、脂類及核酸等雜質，可用下述方法去除：

　　調PH和加熱法：利用蛋白質對酸、堿和熱變性方面性質的差異，可去除非活性雜蛋白。如制備脂肪酶時，在pH3、4時以400C溫度加熱150 min，淀粉酶活力可喪失90%而被除去，而脂肪酶活力仍保持80%以上。

　　蛋白質表面變性法：蛋白質表面變性后其性質有所不同，借以去除雜蛋白。如制備過氧化氫酶時，加入氯仿和乙醇進行振蕩可以將雜蛋白變性而去除。

　　蛋白質沉淀劑法：利用醋酸鋁、利凡諾、單寧酸、離子型表 面活性劑等蛋白質沉淀劑可以去除雜蛋白及粘多糖類雜質。使用時要注意這類試劑常可引起酶變性失活，因此應迅速除去。

　　選擇性變性法：各種蛋白質對變性劑的穩(wěn)定性不同，可以用選擇性變性劑去除雜蛋白。如細胞色素丙對三氯醋酸較穩(wěn)定，所以在制備時可用2.5%三氯醋酸使其他雜蛋白變性使沉淀除去。

　　加保護劑熱變性法：酶與底物或競爭性抑制劑結合后，其穩(wěn)定性常顯著增加。所以常用它們?yōu)楸Ｗo劑，再用一些劇烈手段破壞雜蛋白，如用D-甲基苯甲酸為D-氨基酸氧化酶的保護劑，經加熱除去雜蛋白，使該酶得到很好的提純。

　　核酸沉淀劑法：酶液中的核酸類雜質，可以用氯化錳、魚精蛋白硫酸鹽等沉淀劑使其沉淀而除去。必要時，也可用核糖核酶將核酸降解后除去。

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