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第五節(jié) 結(jié)構(gòu)測(cè)定
苷是由糖和苷元兩部分組成的。
苷的分解，首先了解基本的分子量的大小，就把苷通過(guò)水解的辦法變成兩部分，變成苷元部分、糖部分，然后分別對(duì)苷元部分、糖部分分別來(lái)進(jìn)行結(jié)構(gòu)研究，最后將兩部分結(jié)構(gòu)，拼揍在一起，還原成一個(gè)苷的完整的結(jié)構(gòu)。
一、糖的鑒定
(一)紙色譜
展開劑以正丁醇-乙醇-水和水飽和的苯酚兩種系統(tǒng)應(yīng)用最為普遍。正丁醇醋酸水簡(jiǎn)稱BAW系統(tǒng)，B代表正丁醇，A代表醋酸，W代表水。比例為4:1:5的上層溶液。糖類的紙色譜常用顯色劑有：硝酸銀試劑;三苯四氮唑鹽試劑;苯胺-鄰苯二甲酸鹽試劑;3,5-二羥基甲苯-鹽酸試劑;過(guò)碘酸加聯(lián)苯胺試劑等。
在用紙層吸來(lái)進(jìn)行分離，最常見的糖是葡萄糖和鼠李糖，這兩個(gè)糖Rf值的大小一般的規(guī)律是，鼠李糖因?yàn)闃O性，小于葡萄糖，在用紙色譜檢識(shí)時(shí)，鼠李糖的Rf值一般大于葡萄糖。不同的糖Rf值的大小都會(huì)有比較大的差別。
常用顯色劑有：硝酸銀試劑，使還原糖顯棕黑色;三苯四氮唑鹽試劑，使單糖和還原性低聚糖呈紅色;苯胺-鄰苯二甲酸鹽試劑，使單糖中的五碳糖和六碳糖所呈顏色略有區(qū)別;3，5-二羥基甲苯-鹽酸試劑，使酮糖和含酮糖的低聚糖呈紅色;過(guò)碘酸加聯(lián)苯胺，使糖、苷和多元醇中有鄰羥基結(jié)構(gòu)者呈藍(lán)底白邊。
(二)薄層色譜
糖的極性大，在硅膠薄層上進(jìn)行層析時(shí)，點(diǎn)樣量不宜過(guò)多。若點(diǎn)樣太多，斑點(diǎn)就會(huì)明顯拖尾，Rf值也下降，使一些Rf值相近的糖難以獲得滿意的分離。若硅膠用0.03mol/L硼酸溶液或一些無(wú)機(jī)鹽的水溶液代替水調(diào)制吸附劑涂鋪薄層，則樣品承載量可明顯增加，分離效果也有改善。
(三)氣相色譜
(四)離子交換色譜
(五)液相色譜
二、糖鏈的結(jié)構(gòu)測(cè)定
測(cè)定糖鏈的結(jié)構(gòu)主要解決三個(gè)問題：?jiǎn)翁堑慕M成;糖與糖的連接位置和順序;苷鍵的構(gòu)型。
(一)分子量的測(cè)定 苷的分子量測(cè)定目前大多采用質(zhì)譜法。但由于其極性大導(dǎo)致熱揮發(fā)性差，電子轟擊法(EI)和化學(xué)電離(CI)常不能得到理想的結(jié)果，一般采用場(chǎng)解吸(FD)、快原子轟擊(FAB)、電噴霧(ESI)等方法獲得[M+H]+、[M+Na]+等準(zhǔn)分子離子峰。
(二)單糖的鑒定 苷中糖鏈的研究首先要了解由哪些單糖所組成，各種單糖之間的比例如何。一般是將苷鍵全部酸水解，然后用紙色譜檢出單糖的種類。經(jīng)顯色后用薄層掃描儀求得各種糖的分子比。單糖的定性定量也可以通過(guò)苷全甲基化并水解后得到的甲基化單糖的氣相色譜決定，但需要各種各樣的甲基化單糖作標(biāo)準(zhǔn)品。
(三)單糖之間連接位置的確定
單糖之間連接位置的確定的兩種方法是：苷全甲基化甲醇解，13CNMR苷化位移。
將苷全甲基化，然后水解苷鍵，鑒定所有獲得的甲基化單糖，其中游離的一OH的部位就是連接位置。水解要盡可能溫和，否則會(huì)發(fā)生去甲基化反應(yīng)和降解反應(yīng)。
(四)糖鏈連接順序的確定
早期決定糖連接順序的方法主要是緩和水解法，即用稀酸(包括有機(jī)酸)水解、酶解、乙酰解、堿水解等方法，將苷的糖鏈水解成較小的片段(各種低聚糖)，然后分析這些低聚糖的連接順序，從低聚糖的結(jié)構(gòu)推測(cè)整個(gè)糖鏈的結(jié)構(gòu)。Smith裂解法也廣泛用于糖連接順序的決定，只是分析碎片的工作比較繁瑣。
近年質(zhì)譜分析也已用于糖鏈連接順序的研究。在快原子轟擊質(zhì)譜(FABMS)中有時(shí)會(huì)出現(xiàn)苷分子中依次脫去末端糖的碎片離子峰。如果單糖的質(zhì)量不同，可由此確定糖的連接順序。
目前，2D-NMR和NOE差譜技術(shù)在確定糖鏈連接位置和順序的研究中有了廣泛的應(yīng)用。如在以下化合物HMBC譜中可以觀察到1″-H和7-C，1′″-H和3″-C以及l(fā)″″-H和6″′-C的遠(yuǎn)程相關(guān)，由此可判斷糖與苷元及單糖之間的連接順序。
(五)苷健構(gòu)型的確定
糖與糖之間的苷鍵和糖與非糖部分的苷鍵，本質(zhì)上都是縮醛鍵，也都存在端基碳原子的構(gòu)型問題。測(cè)定苷鍵構(gòu)型的問題主要有三種方法，即酶催化水解方法、分子旋光差法(Klyne法)和NMR法。
1.利用酶水解進(jìn)行測(cè)定 如麥芽糖酶能水解的為α一苷鍵，而杏仁苷酶能水解的為β一苷鍵。但必須注意并非所有的β一苷鍵都能為杏仁苷酶所水解。
2.利用Klyne經(jīng)驗(yàn)公式進(jìn)行計(jì)算
Klyne根據(jù)前人的經(jīng)驗(yàn)，得出一個(gè)計(jì)算公式，即先測(cè)定未知苷鍵構(gòu)型的苷及其水解所得苷元的旋光度，再通過(guò)計(jì)算得到其分子比旋[M]D，然后用苷的分子比旋[M]D苷減去苷元的分子比旋[M]D苷元，求得其差值為△[M]D。公式如下：
△[M]D=[M] D苷一[M] D苷元
3.利用NMR進(jìn)行測(cè)定 1HNMR：葡萄糖，β-苷鍵JH1-H2=6～8Hz，α-苷鍵JH1-H2=3～4Hz。注意鼠李糖、甘露糖不能用上法鑒別。
13CNMR：1JC1-H1=170Hz(α-苷鍵)，1JC1-H1=160Hz(β-苷鍵)。
練習(xí)題
X型題
苷類化合物確定糖鏈結(jié)構(gòu)要解決的問題是
A.糖鏈中糖的元素比
B.糖鏈中糖的種類和比例
C.糖之間的連接位置
D.糖之間的連接順序
E.糖之間苷鍵的構(gòu)型
[答疑編號(hào)111030303]
『正確答案』BCDE
確定苦杏仁苷苷鍵的構(gòu)型，可選用的方法有
A.苦杏仁酶酶解法
B.1H—NMR譜端基H的J值
C.13C—NMR譜端基C的lJch值
D. 13C—NMR譜端基C的δ值
E. 1H—NMR譜端基H的δ值
[答疑編號(hào)111030304]
『正確答案』ABCD
確定苷鍵構(gòu)型的方法有
A. 酸水解法
B. 堿水解法
C. 酶催化水解法
D. 克分子比旋光差(Klyne)法
E. NMR法
[答疑編號(hào)111030305]
『正確答案』CDE
B型題
(1～5)
A.糖的種類
B.苷元的種類
C.苷的分子量
D.單糖間連接位置
E.苷鍵的構(gòu)型
1.苷經(jīng)酸水解后有機(jī)溶劑層的薄層色譜可檢識(shí)
[答疑編號(hào)111030306]
『正確答案』B
2.苷經(jīng)酸水解后水層的紙色譜可檢識(shí)
[答疑編號(hào)111030307]
『正確答案』A
3.苷的1HNMR譜中的JH1—H2 可確定
[答疑編號(hào)111030308]
『正確答案』E
4.苷的13CNMR譜的苷化位移可確定
[答疑編號(hào)111030309]
『正確答案』D
5.苷的FAB-MS可確定
[答疑編號(hào)111030310]
『正確答案』C
第六節(jié) 苦杏仁中所含苷類化合物
苦杏仁苷是一種氰苷，易被酸和酶所催化水解。水解所得到的苷元α-羥基苯乙腈很不穩(wěn)定，易分解生成苯甲醛和氫氰酸。其中苯甲醛具有特殊的香味，通常將此作為鑒別苦杏仁苷的方法。其具體操作為：取本品數(shù)粒，加水共研，發(fā)出苯甲醛的特殊香氣。此外，苯甲醛可使三硝基苯酚試紙顯磚紅色的反應(yīng)也可用來(lái)鑒定苦杏仁苷的存在。具體操作為：取苦杏仁數(shù)粒，搗碎，稱取約0.1g，置試管中，加水?dāng)?shù)滴使?jié)駶?rùn)，試管中懸掛一條三硝基苯酚試紙，用軟木塞塞緊，置溫水浴中，10分鐘后，試紙顯磚紅色。反應(yīng)式見前。
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