第四節(jié) 鑒別與結(jié)構(gòu)測(cè)定
一、色譜法在黃酮類(lèi)化合物鑒別中的應(yīng)用
1.紙色譜(PC)
適用于分離各種天然黃酮類(lèi)化合物及其苷類(lèi)的混合物�；旌衔锏蔫b定常采用雙向色譜法。以黃酮苷類(lèi)為例來(lái)說(shuō)，一般第一向展開(kāi)采用某種醇性溶劑，如n-BuOH-HAc-H2O(4：1：5上層，BAW)，主要是根據(jù)分配作用原理進(jìn)行分離。第二向展開(kāi)溶劑則用水或水溶液，如2%～6%HAc。主要是根據(jù)吸附作用原理進(jìn)行分離。
黃酮類(lèi)化合物的苷元中，平面性較強(qiáng)的分子如黃酮、黃酮醇、查耳酮等，用含水類(lèi)溶劑如3%～5%HAc展開(kāi)時(shí)，幾乎停留在原點(diǎn)不動(dòng)(Rf<0.02);而非平面性分子如二氫黃酮、二氫黃酮醇、二氫查耳酮等，因親水性較強(qiáng)，故Rf值較大(0.10～0.30)。
黃酮類(lèi)化合物分子中羥基苷化后，極性即隨之增大，故在醇性展開(kāi)劑中Rf值相應(yīng)降低，同一類(lèi)型苷元，Rf值依次為：苷元>單糖苷>雙糖苷。但在用水或2%～8%HOAc，3%NaCl水溶液或1%HCl展開(kāi)時(shí)，則上列順序?qū)?huì)顛倒，苷元幾乎停留在原點(diǎn)不動(dòng)，苷類(lèi)的Rf值可在0.5以上，糖鏈越長(zhǎng)，則Rf值越大。
2.硅膠薄層色譜
用于分離與鑒定弱極性的黃酮類(lèi)化合物較好。分離黃酮苷元常用的展開(kāi)劑是甲苯-甲酸甲酯-甲酸(5：4：1)，并可以根據(jù)待分離成分極性的大小適當(dāng)?shù)卣{(diào)整甲苯與甲酸的比例。
3.聚酰胺薄層色譜
適用范圍較廣，特別適合于分離含游離酚羥基的黃酮及其苷類(lèi)。由于聚酰胺對(duì)黃酮類(lèi)化合物吸附能力較強(qiáng)，因而需要用可以破壞其氫鍵締合的溶劑作為展開(kāi)劑。在大多數(shù)展開(kāi)劑中含有醇、酸或水。
二、紫外及可見(jiàn)光譜在黃酮類(lèi)化合物鑒別中的應(yīng)用
1.測(cè)定樣品在甲醇溶液中的UV光譜。
2.測(cè)定樣品在甲醇溶液中加入各種診斷試劑后得到的UV及可見(jiàn)光譜。常用的診斷試劑有甲醇鈉(NaOMe)、乙酸鈉(NaOAc)、乙酸鈉-硼酸(NaOAc-H3B03)、三氯化鋁(AlCl3)及三氯化鋁-鹽酸(AlCl3-HCl)等。
3.如樣品為苷類(lèi)，則可先進(jìn)行水解，或甲基化后再水解，并測(cè)定苷元或其衍生物的UV光譜。各種診斷試劑的詳細(xì)配制方法及測(cè)定程序可參看有關(guān)文獻(xiàn)。
(一)黃酮類(lèi)化合物在甲醇溶液中的UV光譜特征
黃酮、黃酮醇等多數(shù)黃酮類(lèi)化合物，因分子中存在如下所示的桂皮�；氨郊柞；M成的交叉共軛體系，故其甲醇溶液在200～400nm的區(qū)域內(nèi)存在兩個(gè)主要的紫外吸收帶，稱(chēng)為峰帶Ⅰ(300～400nm)及峰帶Ⅱ(220～280nm)。
1.黃酮及黃酮醇類(lèi)
兩者UV光譜譜形相似，但帶Ⅰ位置不同，可據(jù)此進(jìn)行分類(lèi)：黃酮帶Ⅰ<350nm，黃酮醇帶Ⅰ>350nm。
2.查耳酮及橙酮類(lèi)
共同特征是帶Ⅰ很強(qiáng)，為主峰;而帶Ⅱ則較弱，為次強(qiáng)峰。
3.異黃酮、二氫黃酮及二氫黃酮醇
這三類(lèi)化合物中，除有由A環(huán)苯甲酰系統(tǒng)引起的帶Ⅱ吸收(主峰)外，因B環(huán)不與吡喃酮環(huán)上的羰基共軛(或共軛很弱)，故帶Ⅰ很弱，常在主峰的長(zhǎng)波方向處有一肩峰。
根據(jù)主峰的位置，可以區(qū)別異黃酮與二氫黃酮及二氫黃酮醇類(lèi)。前者在245～270nm，后兩者在270～295nm。
(二)加入診斷試劑后引起的位移及其在結(jié)構(gòu)測(cè)定中的意義
1.加入診斷試劑后黃酮及黃酮醇類(lèi)化合物的紫外光譜幾種主要的診斷試劑引起的位移及其結(jié)構(gòu)特征歸屬見(jiàn)表6-9。
表6-9 加入診斷試劑的黃酮及黃酮醇類(lèi)化合物UV圖譜及結(jié)構(gòu)特征的歸屬
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診斷試劑 |
帶Ⅱ |
帶Ⅰ |
歸屬 |
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NaOMe |
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紅移40～60nm，強(qiáng)度不降 |
示有4ˊ-OH |
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紅移50～60nm，強(qiáng)度下降 |
示有3-OH，但無(wú)4ˊ-OH | |
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吸收譜圖隨時(shí)間延長(zhǎng)而衰退 |
示有對(duì)堿敏感的取代基，如3，4ˊ-、3，3ˊ，4ˊ-、5，6，7-、5，7，8-、3ˊ，4ˊ，5ˊ-羥基取代基等 | ||
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NaOMe（未熔融） |
紅移5～20nm |
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示有7-OH |
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在長(zhǎng)波一側(cè)有明顯肩峰 |
示有4ˊ-OH，但無(wú)3-或7-OH | |
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NaOMe（熔融） |
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紅移40～65nm，強(qiáng)度下降 |
示有4ˊ-OH |
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吸收譜圖隨時(shí)間延長(zhǎng)而衰退 |
示有對(duì)堿敏感的取代基（如同上示） | ||
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NaOAc/H3BO3 |
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紅移12～30nm |
示B環(huán)有鄰二酚羥基結(jié)構(gòu) |
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紅移5～10nm |
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示A環(huán)有鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)（但不包括5、6位） | |
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AlCl3及AlCl 3/HCl/HCl |
AlCl3/HCl譜圖與AlCl3譜圖相同 |
示結(jié)構(gòu)中無(wú)鄰二酚羥基結(jié)構(gòu) | |
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AlCl3/HCl譜圖與AlCl3譜圖不同 |
示結(jié)構(gòu)中可能有鄰二酚羥基 | ||
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ALCl3/HCl譜圖與MeOH譜圖相同 |
示無(wú)3-及/或5-OH | ||
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ALCl3/HCl譜圖與MeOH譜圖不同 |
示可能有3-及/或5-OH | ||
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